Rola i mechanizm molekularny kwasu D-asparaginowego w uwalnianiu i syntezie LH i testosteronu u ludzi i szczurów
Kwas D-asparaginowy jest aminokwasem występującym w tkankach neuroendokrynnych bezkręgowców i kręgowców, w tym szczurów i ludzi. Tutaj badaliśmy wpływ tego aminokwasu na uwalnianie LH i testosteronu w surowicy ludzi i szczurów. Ponadto zbadaliśmy rolę D-asparaginianu w syntezie LH i testosteronu w przysadce mózgowej i jądrach szczurów oraz mechanizmy molekularne, za pomocą których ten aminokwas wyzwala swoje działanie.
Dla ludzi: grupa 23 mężczyzn podawano dzienną dawkę D-asparaginianu (DADAVIT ® ) przez 12 dni, podczas gdy inna grupa 20 mężczyzn podawano placebo. Dla szczurów: Grupa 10 szczurów piła roztwór 20 mM D-asparaginianu lub placebo przez 12 dni. Następnie oznaczono akumulację LH i testosteronu w surowicy oraz akumulację D-asparaginianu w tkankach. Wpływ D-asparaginianu na syntezę LH i testosteronu oceniano na izolowanych komórkach przysadki mózgowej szczura i komórkach Leydiga. Tkanki inkubowano z D-asparaginianem, a następnie oznaczono stężenie (syntezę) LH i cGMP w przysadce oraz testosteronu i cAMP w komórkach Leydiga.
U ludzi i szczurów D-asparaginian sodu zwiększa uwalnianie LH i testosteronu. W przysadce mózgowej szczura D-asparaginian sodu zwiększa uwalnianie i syntezę LH poprzez zaangażowanie cGMP jako drugiego przekaźnika, podczas gdy w jądrach szczurów komórek Leydiga, zwiększa syntezę i uwalnianie testosteronu i cAMP jako drugiego przekaźnika. W przysadce mózgowej i jądrach D-Asp jest syntetyzowany przez racemazę D-asparaginianową, która przekształca L-Asp w D-Asp. Przysadka i jądra mają dużą zdolność do wychwytywania krążącego D-Asp ze źródeł heksogenu lub endogenów.
Kwas D-asparaginowy jest fizjologicznym aminokwasem występującym głównie w przysadce mózgowej i jądrach i odgrywa rolę w regulacji uwalniania i syntezy LH i testosteronu u ludzi i szczurów.
Kwas D-asparaginowy (D-Asp) jest aminokwasem endogennym występującym w tkankach neuroendokrynnych zarówno bezkręgowców, jak i kręgowców [ 1 ]. D-Asp po raz pierwszy stwierdzono w układzie nerwowym mięczaków morskich [ 2 ], a następnie w tkankach nerwowych i endokrynologicznych wielu innych zwierząt, w tym ludzi [ 1 ]. Wysokie poziomy D-Asp występują przejściowo w mózgach kurczaków, szczurów i ludzi w ostatnim okresie życia embrionalnego, co sugeruje, że odgrywa on rolę w rozwoju układu nerwowego [ 3 - 6 ]. Ponadto w układzie nerwowym aminokwas ten jest skoncentrowany w zakończeniach aksonów (synaptosomach) oraz w pęcherzykach synaptycznych razem z L-Asp i L-Glu [ 7]; ponadto bierze udział w aktywności wzrokowej [ 8 ], co sugeruje, że odgrywa rolę w neuroprzekaźnictwie.
W układzie hormonalnym wysokie stężenia D-Asp odnotowano w jądrach szczurów przy urodzeniu, jak również po osiągnięciu dojrzałości płciowej [ 5 ]. Dalsze badania na szczurach wykazały najwyższe stężenia D-Asp w osoczu krwi żylnej jąder, a także w jądrach rete, najądrzu, komórkach miąższowych jąder, kanalikach nasiennych, płynie śródmiąższowym i plemnikach [ 9 ], co sugeruje, że zaangażowany w spermatogenezę. Specyficzną lokalizację D-Asp obserwowano ponadto w jądrach szczurów w wydłużonych plemnikach [ 10 ] lub w komórkach Leydiga [ 11 ]. Kilka dalszych badań wykazało, że D-Asp jest skoncentrowany w gruczole dokrewnym, szczególnie w szyszynce, przysadce mózgowej i jądrach [ 1, 12 ]. Zaobserwowano, że D-Asp u szczurów jest zdolny do wywoływania uwalniania hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) z podwzgórza, hormonu luteinizującego (LH) i hormonu wzrostu (GH) z przysadki mózgowej oraz testosteronu z jądra [ 13 ]. Ponadto D-Asp występuje w wysokim stężeniu w szyszynce [ 14 ], gdzie moduluje syntezę melatoniny w pinealocytach szczurów [ 15 ] i bierze udział w hormonie stymulującym α-melanocyty, GABA, oraz w uwalnianiu dopaminy [ 16]. U owiec D-Asp występuje endogennie w tkankach i jest elekcyjnie magazynowany w gruczołach dokrewnych, takich jak przysadka mózgowa, oraz w mózgu po podaniu. NMDA i LH wzrosły po podaniu D-Asp [ 17 ]. Niedawno badanie in vitro przeprowadzone na jądrach knurów ujawniło, że endogenna D-Asp w jądrach zwiększa aktywność aromatazy gonad [ 18 ], kluczowego enzymu przekształcającego testosteron w 17β-estradiol. Ponadto badania przeprowadzone na jądrach i jajniku jaszczurki Podarcis s. sicula wykazali podobne wyniki, potwierdzając, że D-Asp bierze udział w miejscowej produkcji estrogenu [ 19 , 20 ].
Na podstawie powyższych ustaleń wydaje się, że D-Asp odgrywa kluczową rolę w rozmnażaniu ze względu na sugerowaną rolę neuromodulatora lub bierze udział w biosyntezie i uwalnianiu hormonów płciowych. W ostatnich badaniach analizowano rolę D-Asp w reprodukcji człowieka zarówno u samic, jak iu samców. U mężczyzn mniejszą zawartość D-Asp stwierdzono w oligoastenoteratospermie w płynie nasiennym i plemnikach, a istnieje związek między ilością i ruchliwością nasienia a zawartością D-Asp [ 21]. U kobiet stwierdzono, że D-Asp występuje w płynie pęcherzykowym jako składnik fizjologiczny i, co ciekawe, stężenie D-Asp w płynie jest obniżone u starszych kobiet. Ponadto stężenie D-Asp w płynie pęcherzykowym jest mniejsze, podobnie jak jakość oocytów i poziom zapłodnienia [ 22 ].
Chociaż przeprowadzono wiele badań w tej sprawie, do tej pory nie przeprowadzono żadnych badań nad wpływem D-Asp na wydzielanie LH i testosteronu u ludzi, ani też nie ma mechanizmu molekularnego, za pomocą którego D-Asp wyzwala to działanie w badano syntezę i uwalnianie tych hormonów. Niniejsze badanie ma na celu ocenę wpływu podawania D-asparaginianu na produkcję LH i testosteronu u ludzi i szczurów oraz zrozumienie mechanizmów biochemicznych, poprzez które D-Asp indukuje syntezę i uwalnianie LH i testosteronu, wykorzystując szczury jako zwierzę modelowe.
Wpływ D-asparaginianu na uwalnianie LH i testosteronu u ludzi
W tym badaniu 23 uczestników przyjmowało doustną dawkę D-asparaginianu sodu (DADAVIT ® ) przez 12 kolejnych dni, a 20 uczestników przyjmowało doustną dawkę placebo (DADAVIT ® placebo) przez 12 kolejnych dni; poziomy LH i testosteronu w surowicy monitorowano po 6 i 12 dniach leczenia oraz 3 dni po zawieszeniu leczenia (z D-asparaginianem lub placebo).
Jeśli chodzi o wzorzec LH, wyniki wykazały, że po 12 dniach leczenia D-Asp 20 z 23 (87%) uczestników miało istotnie podwyższone stężenia LH we krwi w stosunku do wartości podstawowych (wartość LH stwierdzona w tym samym pacjentów przed rozpoczęciem leczenia). Analiza statystyczna wykazała, że wartość (średnia ± SEM) surowicy obliczona dla wszystkich 23 pacjentów leczonych D-Asp wzrosła o 33,3%. Od średniej wartości wyjściowej 4,2 ± 0,5 mIU / ml LH wzrosła do średniej wartości 5,6 ± 0,9 mIU / ml (TabelaWcześniejsze(Tabela 1).1). Wzrost był istotny statystycznie (ANOVA z powtarzanymi pomiarami: [F (2,82) = 24,279, p <0,0001]). Stężenie LH określone w grupie placebo po leczeniu D-Asp w porównaniu z poziomem przed leczeniem nie wzrosło [ANOVA: F (1,82) = 0,643, p> 0,427]), co wskazuje, że wzrost LH spowodowany D- leczenie asparaginianem było autentyczne. Wpływ D-asparaginianu na wzrost LH był zależny od czasu. Gdy badani pili D-asparaginian sodu przez 6 dni, LH wzrósł tylko 1,07-krotnie, a wartość ta nie była istotna statystycznie (tab.Wcześniejsze(Tabela 1).1). Jednak, gdy leczenie D-Asp kontynuowano przez 12 kolejnych dni, stężenie LH w surowicy znacznie wzrosło (efekty korzyści). Aby wiedzieć, jak długo LH pozostawał podwyższony we krwi po zawieszeniu leczenia, mierzyliśmy stężenie LH w surowicy 3 dni po podaniu D-Asp lub zawieszeniu leczenia placebo. Wyniki wskazywały, że 3 dni po zawieszeniu leczenia D-Asp, poziom LH był nadal 1,14-krotnie wyższy w porównaniu z poziomem podstawowym, ale nie był istotny statystycznie.
Tabela 1
Wpływ D-asparaginianu na uwalnianie LH i testosteronu w ludzkiej surowicy
| Leczenie na poziomach podstawowych | Po 6 dniach kuracji D-Asp | Po 12 dniach D-Asp | 3 dni po zawieszeniu D-Asp | |
| LH (mIU / ml surowicy) | ||||
| Osoby leczone asparaginianem Na-D | 4,2 ± 0,5 | 4,5 ± 0,6 | 5,6 ± 0,9 * | 4,8 ± 0,8 |
| Osoby leczone placebo | 4,2 ± 0,4 | 4,3 ± 0,7 | 4,2 ± 0,6 | 4,1 ± 0,5 |
| Testosteron (ng / ml surowicy) | ||||
| Pacjenci leczeni asparaginianem Na-D | 4,5 ± 0,6 | 5,2 ± 0,7 | 6,4 ± 0,8 * | 5,8 ± 0,6 * |
| Osoby leczone placebo | 4,6 ± 0,5 | 4,5 ± 0,7 | 4,7 ± 0,7 | 4,6 ± 0,7 |
Te wyniki to średnia ± SEM LH i testosteronu w surowicy 23 uczestników (w wieku 27-37 lat) w czasie zerowym (poziomy podstawowe), po 6 dniach i 12 dniach leczenia D-asparaginianem i 3 dni po zawieszeniu leczenia . Osoby badane wypijały dzienną dawkę DADAVIT ® (N-D-asparaginian). Leczenie placebo przeprowadzono na kolejnych 20 uczestnikach w tym samym wieku, którzy wypijali dzienną dawkę placebo DADAVIT ® . Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą ANOVA z powtarzanymi pomiarami (test post-hoc). * Wartości są istotne statystycznie dla p <0,001.
Jeśli chodzi o wpływ D-Asp na indukcję uwalniania testosteronu, po 12 dniach leczenia D-Asp, poziomy testosteronu w surowicy uczestników były znacznie zwiększone w porównaniu z poziomami podstawowymi. Spośród 23 uczestników 20 miało podwyższony poziom testosteronu. Ze średniej 4,5 ± 0,6 ng / ml surowicy w momencie zerowym wzrosła do 6,4 ± 0,8 ng / ml, co stanowi wzrost o 42% (tabelaWcześniejsze(Tabela 1).1). Analizy statystyczne wykazały istotny wpływ [ANOVA z powtarzanymi pomiarami: efekt leczenia: F (1,82) = 7,724, p <0,0082] i istotną interakcję między leczeniem a dniami [F (2,82) = 32,599; P <0,0001]. Podobnie jak w przypadku LH, tak i w przypadku testosteronu, działanie D-asparaginianu było zależne od czasu. Gdy osobnicy byli leczeni D-asparaginianem sodu tylko przez 6 dni, testosteron był 1,15-krotnie wyższy niż poziom podstawowy, ale wzrost ten nie był istotny statystycznie (tab.Wcześniejsze(Tabela 1).1). Co ciekawe, 3 dni po zawieszeniu traktowania D-Asp, testosteron był nadal zwiększony 1,22-krotnie w porównaniu z poziomami podstawowymi (5,8 ± 0,6 ng / ml wobec 4,5 ± 0,6 ng / ml). Analiza post-hoc Fishera również wykazała istotną różnicę w stężeniu testosteronu w surowicy 3 dni po zakończeniu leczenia (p <0,01) (tab.Wcześniejsze(Tabela 1).1). Jednym z prawdopodobnych wyjaśnień tego zjawiska jest to, że ponieważ u szczurów połknięty D-Asp pozostaje gromadzony w jądrach w znaczących ilościach do 3 dni po zawieszeniu leczenia D-Asp (patrz poniżej), jeśli zakłada się, że u ludzi również D-Asp pozostaje znacznie zwiększony w jądrach 3 dni po zawieszeniu leczenia D-Asp, możemy wywnioskować, że u ludzi, podobnie jak u szczurów, D-Asp pozostawał w znacznych ilościach w jądrach iw konsekwencji nadal stymulował uwalnianie testosteronu.
Dyskusja
W pracy wykorzystano specyficzną metodę HPLC połączoną z D-AspO (ryc. Wcześniejsze(Ryc.1)1) oraz specyficzne immunoenzymatyczne metody oznaczania LH i testosteronu, a także drugich przekaźników, cAMP i cGMP, wykazaliśmy, że kwas D-asparaginowy odgrywa rolę w uwalnianiu i syntezie LH i testosteronu u ludzi i szczurów. U ludzi stwierdziliśmy, że przy spożyciu dziennej dawki 10 ml 2 M roztworu D-asparaginianu sodu (3,12 g) przez 12 kolejnych dni, poziomy LH i testosteronu w surowicy znacznie wzrosły, o 33% i 42 % odpowiednio. U 87% badanych leczonych D-asparaginianem sodu zwiększyło się stężenie LH i testosteronu w surowicy (p <0,0001). Stwierdzono, że po 6 dniach leczenia poziom LH wzrósł, ale wzrost ten nie był istotny statystycznie (tabWcześniejsze(Tabela 1).1). Trzy dni po zawieszeniu D-asparaginianu sodu nadal stwierdzono wyższy poziom LH niż poziomy podstawowe (wzrost 1,14-krotny), ale wzrost ten nie był istotny statystycznie (tab.Wcześniejsze(Tabela 1),1), co wskazuje, że wzrost LH był zależny od dawki. Spożycie D-asparaginianu sodu u ludzi również indukowało znaczące uwalnianie testosteronu w surowicy. W rzeczywistości u tych samych osób, które przyjmowały D-Asp przez 12 dni, poziom testosteronu znacznie wzrósł. ANOVA z powtarzanymi pomiarami wskazała istotną wartość (p <0,0001). Podobnie jak w przypadku LH, tak również w przypadku testosteronu, 6 dni leczenia indukowało wzrost poziomu testosteronu w surowicy krwi, ale wzrost ten nie był znaczący. Co ciekawe, w przeciwieństwie do tego, co miało miejsce w przypadku LH, trzy dni po zawieszeniu leczenia, testosteron nadal pozostawał zwiększony w surowicy 1,28-krotny wzrost w porównaniu z poziomami podstawowymi i wzrost ten był istotny (p <0,01) (tab.Wcześniejsze(Tabela 1).1). Możliwym wytłumaczeniem tego zdarzenia jest to, że połknięty D-Asp prawdopodobnie również gromadził się w jądrach 3 dni po zaprzestaniu leczenia i nadal stymulował produkcję testosteronu w jądrach. Tę hipotezę potwierdzają wyniki uzyskane na szczurach. W rzeczywistości po tym, jak szczury piły roztwór 20 mM D-Asp przez 12 dni, aminokwas ten gromadził się w różnych tkankach, zwłaszcza w przysadce mózgowej i jądrach (tab.Wcześniejsze(Tabela 3).3). Jednak po zawieszeniu leczenia D-Asp, D-Asp, który gromadził się w tkankach, zmniejszał się, aż osiągnął poziomy podstawowe, z wyjątkiem jąder, gdzie D-Asp nadal pozostawał znacząco zwiększony 1,88-krotnie (TabelaWcześniejsze(Tabela 33).
W tym badaniu wykorzystaliśmy szczury jako zwierzęta modelowe, aby zrozumieć mechanizm molekularny, za pomocą którego D-Asp wywołuje swoje działanie. Szczurom pozwolono pić roztwór sodu D-Asp przez 12 dni, a następnie określono stężenie D-Asp, które gromadziło się w tkankach, wraz ze stężeniem LH i testosteronu. U szczurów i ludzi, D-Asp również aktywnie indukował uwalnianie LH i testosteronu. W rzeczywistości, gdy szczurom podawano D-Asp, po 12 dniach leczenia obserwowano znaczący wzrost LH i testosteronu (tabelaWcześniejsze(Tabela 2),2), zbiegające się ze zwiększonym poziomem D-Asp w odpowiednio przysadce i jądrach (tab Wcześniejsze(Tabela 2).2). Zatem dane te wskazują, że D-Asp bierze udział w regulacji powyższych hormonów.
Eksperymenty in vitro przeprowadzone na izolowanej przysadce mózgowej szczura inkubowanej z D-Asp wykazały, że D-Asp w stężeniu 0,1 mM w pożywce jest zdolny do indukowania syntezy LH (ryc.Wcześniejsze(Ryc. 2,2lewy panel) i testosteron (ryc. Wcześniejsze(Ryc. 3,3lewy panel). Ponadto, gdy przysadka mózgowa była inkubowana z 0,1 mM D-Asp, wystąpił istotny wzrost cGMP w badanej mieszaninie (ryc.Wcześniejsze(Ryc. 3,3, prawy panel), co wskazuje, że uwalnianie i synteza LH zachodziła pod wpływem cGMP. Dane te są zgodne z wcześniejszymi wynikami uzyskanymi przez innych badaczy [ 27 - 29 ], który wykazał, że cząsteczka udział w transdukcji sygnału dla innych metabolitów w przysadce szczura był cGMP. Podobnie, eksperymenty in vitro przeprowadzone na izolowanych komórkach Leydiga inkubowanych w pożywce zawierającej 0,1 mM soli sodowej D-Asp wykazały, że ten aminokwas jest zdolny do indukowania syntezy testosteronu (ryc.Wcześniejsze(Ryc. 3,3, lewy panel) i że w zdarzeniu tym pośredniczy cAMP, który działa jako cząsteczka zaangażowana w przekazywanie sygnału do syntezy testosteronu z komórek Leydiga szczura (ryc. Wcześniejsze(Ryc. 3,3prawy panel). Również ten ostatni wynik jest zgodny z wcześniejszymi badaniami innych badaczy, w których wykazano, że wzrost poziomu testosteronu syntetyzowanego przez komórki Leydiga następuje pod wpływem interwencji cAMP [ 30 ]. Ostatnim celem tego badania było zbadanie biosyntezy D-Asp w przysadce i jądrach. Wyniki wykazały, że tkanki szczurów mają aktywność racemazy, która jest zdolna do przekształcania L-Asp w D-Asp. Nazwaliśmy ten enzym „racemazą D-asparaginianową” i jest obecny we wszystkich analizowanych tkankach szczurów. Przysadka i jądro to tkanki o wyższym stężeniu (ryc.Wcześniejsze(Ryc.4).4). Dane te wskazują zatem, że istnieje związek pomiędzy endogennym stężeniem D-Asp a stężeniem racemazy D-asparaginianowej w tkankach (ryc.Wcześniejsze(Ryc.44).
W tym badaniu zbadaliśmy również działanie L-Asp na uwalnianie hormonów u szczurów. Grupie 10 samców szczurów leczono L-Asp zamiast D-Asp w tym samym czasie i w tym samym stężeniu, a następnie oznaczono poziom LH i testosteronu we krwi. Wyniki tego badania wskazały, że L-Asp nie indukuje żadnego znaczącego wzrostu LH lub testosteronu w surowicy (dane nieprzedstawione), wskazując tym samym, że tylko stereochemiczna postać D-Asp jest aktywna w uwalnianiu hormonu.
Wniosek
Tutaj wykazaliśmy, że kwas D-asparaginowy, który występuje jako związek fizjologiczny w przysadce mózgowej i jądrach ssaków, odgrywa rolę w regulacji uwalniania i syntezy LH i testosteronu. U ludzi i szczurów leczenie D-Asp sodem zwiększa uwalnianie LH i testosteronu. Eksperymenty, które przeprowadziliśmy na szczurach, pozwoliły nam zrozumieć, że ten aminokwas reguluje syntezę LH i testosteronu odpowiednio w przysadce i jądrach. W przysadce pośredniczy cGMP, aw jądrach cAMP, które pełnią rolę drugich przekaźników w przewodzeniu sygnałów odpowiednio w przysadce i jądrach. Przysadka i jądra posiadają racemazę D-asparaginianową, która zapewnia niezbędną produkcję D-Asp.
Z
doświadczenia jednak wiem, że nie u wszystkich działa DAA w ten sam
sposób, u niektórych osób podnosił Testosteron, estradiol, DHEA,
prolaktynę u innych nie podnosił wcale albo nieznacznie.
Źródło: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2774316/